CRISPR文库筛选揭示促氧化剂抗癌新机制

CRISPR文库筛选揭示促氧化剂抗癌新机制

前列腺癌是男性高发癌症，易进展为转移性耐药肿瘤。尽管抗氧化剂维生素E曾被寄予厚望，但大规模试验（SELECT）却意外发现其增加患癌风险。这一矛盾促使研究者转向促氧化剂的潜在抗癌作用。Manojit M. Swamynathan等人在《Science》上发表了题为“Dietary pro-oxidant therapy by a vitamin K precursor targets PI 3-kinase VPS34 function”的研究论文，他们通过RapidCaP转基因小鼠模型，结合全基因组CRISPR文库筛选，揭示促氧化剂MSB通过靶向VPS34激酶诱导新型氧化性细胞死亡（triaptosis），为前列腺癌治疗提供新策略。

抗氧化剂维生素E的使用与前列腺癌的风险正相关，那么相反地，促氧化剂补充是否能帮助预防前列腺癌？

促氧化剂（menadione sodium bisulfite，MSB）影响前列腺癌细胞的作用机制是什么？靶点是什么？

促氧化剂是否能作为一种潜在的治疗手段，应用于前列腺癌，和其他癌症以及其他相关疾病的治疗，如X连锁肌管肌病？

动物实验：使用RapidCaP模型小鼠，通过给予促氧化剂MSB，观察其对前列腺癌进展的抑制效果。通过生物发光成像（BLI）监测前列腺癌的强度和扩散情况。

基因组学分析：对MSB耐药的RapidCaP小鼠的单个细胞核进行全基因组拷贝数变异（CNA）分析，鉴定和表征。并进一步确认MSB耐药细胞系的遗传依赖性。

CRISPR筛选：进行全基因组CRISPR筛选，包括敏感性筛选和抗性筛选，以鉴定与MSB杀伤功能相关的基因。

MSB能显著抑制前列腺癌在小鼠中的进展(图1)，通过一种独特的氧化细胞死亡机制—triaptosis（三联凋亡）来杀死癌细胞。

图1 MSB抑制小鼠前列腺癌的发展

为了找到MSB作用的靶点，该实验室构建了CRISPR 筛选文库。具体构建过程是使用Brunello CRISPR全基因组敲除文库（该文库包含77,441个sgRNA，靶向人类基因组中的19,114个基因），让每个sgRNA至少在1,000个PC3细胞中得到表达同时进行了正向和负向地筛选，以确认哪些基因的敲除会分别增加和降低PC3对于MSB的敏感性，结果有可能有助于分析出MSB的作用靶点。

图2. CRISPR文库构建，病毒包装和感染细胞。随后分别用低浓度的MSB和高浓度MSB进行负向和正向筛选

经过筛选发现VPS15敲除和MTM1敲除分别提升和削弱了前列腺癌细胞对MSB的敏感性，而VPS15和MTM1分别正向和负向地作用于同一个生化反应，即早期endosome的PI(3)P标记，这强烈提示MSB也可以直接作用于这个生化反应。最直接的假设就是MSB作为氧化剂氧化并抑制了相关酶的活性，后续实验支持了MSB直接氧化Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶VPS34上的关键半胱氨酸残基，从而使这个产生PI(3)P的酶失活。

图3. CRISPR文库筛选得出强烈提示MSB作用于内体PI(3)P标记这一过程

那么MSB能特异性抑制VPS34活性这个功能是否可以在其他病理模型进行验证呢？在X连锁肌管肌病模型中，由于拮抗VPS34作用的Mtm1的突变丢失打破了PI(3)P标记的生理平衡。而实验显示MSB恰好治疗可改善肌肉组织学和功能，并延长寿命，这可能是因为MSB抑制了VPS34激酶活性，使PI(3)P水平回到能够改善肌肉发育的程度。

图4. MSB可以延缓X连锁肌管肌病进展，可能的作用途径是通过抑制VPS34的活性

该研究揭示了促氧化剂在癌症治疗中的潜力，尤其是针对前列腺癌这一常见且难治的癌症类型。MSB能够通过靶向VPS34来抑制前列腺癌的进展，为开发新的治疗策略提供了理论基础。研究还发现了促氧化剂选择性作用的新机制，即通过影响细胞内特定的氧化还原敏感途径来发挥作用。这为设计更精准的促氧化剂治疗提供了思路，有望在多种疾病背景下产生意外的治疗机会。

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参考文献：Manojit M. Swamynathan et al. ,Dietary pro-oxidant therapy by a vitamin K precursor targets PI 3-kinase VPS34 function.Science386,eadk9167(2024).DOI:10.1126/science.adk9167